干細胞在細胞治療、組織工程和再生醫學以及制藥和生物技術應用方面具有巨大前景。它們具有自我更新的能力，并能夠根據分離來源分化成特定的細胞類型。然而，干細胞在臨床應用中的使用需要高質量和大量的細胞，這需要大規模擴增干細胞。傳統的細胞維持和擴增方法依賴于使用平面塑料培養板和異種培養基的2D培養技術，這些方法的擴增有限，細胞在長期傳代后往往會失去克隆和分化能力。干細胞的3D擴增新方法強調3D細胞生長以模擬體內環境。本文將簡要介紹干細胞3D擴增系統中微載體、生物反應器以及培養基等的上游工藝的最新進展以及策略選擇。
微載體的選擇
由于通常從天然來源獲得的干細胞數量較少，GMP級干細胞培養面臨的主要挑戰之一是選擇最佳擴增系統。該系統必須使用無異種培養基、生長因子和添加物擴增未分化狀態的干細胞。3D生物反應器是克服靜態培養限制的可行選擇，因為它們提供了一個可放大的系統，其中可以監控和控制操作因素。
關于培養系統的首要選擇要素是生物反應器的類型，必須考慮擴增細胞的最終應用。例如，攪拌罐生物反應器是相對簡單的培養系統，由一個帶有攪拌槳的容器組成，攪拌槳攪拌內部物質以提供均勻的培養液。此類培養系統已成功測試了在無異種條件下擴增不同類型的干細胞，包括間充質干細胞 (MSC)、誘導性多能干細胞 (iPSC) 和胚胎干細胞（ESC）。使用這些系統時需要關注產生的剪切應力，可能會損壞對剪切敏感的細胞，通過控制攪拌槳的形狀和攪拌速度，可以最大限度地減少這一問題。
該類生物反應器系統中必須監測和控制的另一個重要參數是氧飽和度。在不同 O2濃度下培養的干細胞可能在細胞增殖、活力和分化能力方面表現出顯著差異。一些研究測試了在低氧飽和度（約 5%）下培養iPSC和 ESC，在缺氧條件下觀察到細胞從有氧到無氧途徑的顯著代謝變化。但這種情況導致乳酸濃度升高，培養基的 pH 值從中性變為酸性。當在 ESC培養中使用 30% 的氧飽和度時，實現了更高的代謝和細胞生長率。
生物反應器的設計對于臨床級干細胞的擴增至關重要，并且必須完全符合GMP法規，而生物反應器容器特性（例如材料、尺寸和形狀）是影響細胞生產并最終影響生物工藝成本的關鍵參數。生物反應器的材料和設計應便于清潔和生產步驟，從而防止任何污染的可能性。在這方面，一些生物反應器系統已經開發出使用一次性裝置作為避免清潔過程和降低污染風險的新策略。
上述系統可以與微載體結合，從而將系統的特性與其融合在一起，所以，未來的趨勢可能集中在探索這些具有不同微載體特性的生物反應器系統，以針對特定的干細胞類型，最大限度地提高細胞產量，同時保持其活力和多能性。
培養基和添加物
維持和擴增干細胞所需的培養基、生長因子、細胞因子和其它添加物是上游生物工藝中的關鍵元素。培養基配方中包含異種或未定義的化合物以及對細胞功能所涉及的多種分子和細胞機制的不理解是需要解決的主要問題。培養基和添加物中的異種成分具有潛在危險，因為它們可能含有可傳播給培養細胞的致病因子，從而阻礙其用于醫療應用。例如，胎牛血清 (FBS) 是一種低分子量和高分子量生物分子的異種復合混合物，傳統上被包含在培養基配方中以促進細胞生長。然而，眾所周知，它們的生產批次間含量存在顯著差異，從而改變了生物分子的批次間濃度和工藝的可重復性。這在GMP級干細胞培養中必須完全避免，因為它可能含有不良因素，如：內毒素、支原體、病毒污染物和朊病毒蛋白。
干細胞培養配方中經常添加促進未分化狀態細胞增殖的細胞因子和生長因子。這些添加物通常來自異種來源，因此它們在臨床干細胞培養中的使用也受到阻礙。但目前已經有很多無異種材料的開發和干細胞培養的應用，而有關使用無異種培養基的報道已證實了細胞的擴增能力及其在整個培養過程中保持分化潛能的能力。
細胞分離
細胞與微載體分離是直接影響細胞活力的重要步驟。目前，已經開發了不同的分離策略，這些策略與基于微載體的生物工藝完全兼容。其中，基于蛋白水解酶的方法最為常用。傳統上，胰腺衍生的牛和豬胰蛋白酶是廣泛用于細胞分離的酶。盡管這些酶很有效，但它們的動物來源使其無法用于醫療環境，必須探索無異種替代品。重組胰蛋白酶樣酶，如 TrypLE 和 TrypZean是解決胰蛋白酶使用不便的辦法。雖然這些酶在不同的生物體中表達，但它們在不同的比較研究中表現出與胰蛋白酶相似的干細胞分離活性。
另一個需要考慮的因素是酶孵育時間對細胞表達標志物的影響。如研究顯示，胰蛋白酶在 30 分鐘時會降低多種細胞表面表達標志物，而 TrypLE 不會影響任何一種。另有研究顯示，MSC過度暴露于 TrypLE 酶（60 分鐘）可顯著降低多能性表達標志物。酶孵育時間是成功實現細胞分離而不影響細胞完整性和活力的重要參數。雖然較長的酶孵育時間與細胞損傷和細胞死亡有關，但由于蛋白質鍵的不完全斷裂，短時間會阻礙細胞分離。因此，必須嚴格規范細胞與酶的接觸時間，以防止細胞活力及其特性的下降。為了克服這種時間上的挑戰，研究將胰蛋白酶孵育與攪拌相結合，這減少了酶孵育時間并減少了細胞對酶活性的過度暴露。其它的替代方案是使用刺激響應性材料來克服酶促分離的缺點。這些材料可以與外部刺激發生反應，例如溫度、pH 值或電解質濃度的變化，從而導致其尺寸/大小、結構、溶解度或分子間相互作用發生改變。從這個意義上說，目前的趨勢是尋找簡化分離過程并減少或最終消除酶使用的新材料。用于藥物遞送系統、納米顆粒和組織工程應用的新型材料可以推廣到微載體的制造。
多寧生物結合旗下子公司，擁有多年生物反應器系統性開發和設計經驗，產品符合現代生物反應器的技術要求，利用高品質的衛生級和工業級的配件，保證最佳性能和操作的高度安全性。其中，BC系列反應器包括玻璃生物反應器以及不銹鋼生物反應器，結合成熟的微載體培養技術，可培養大多數的貼壁細胞，工藝成熟、產品種類齊全，加上自主研發的無泡通氣技術，既保證了溶氧，又避免了氣泡破碎對微載體的影響，且對目前行業中所用到的微載體細胞培養都有良好的適用性。
我們擁有多年與用戶協同進行工藝開發的經驗，包括二倍體細胞、Vero細胞、干細胞以及各組織來源的原代細胞，可協助工藝優化、規模放大等工作。
*詳細產品信息，請聯系marketing@duoningbio.com
C.McKee, G.R.Chaudhry, Advances and challenges in stem cell culture. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, 2017.
A.Ebrahimian, M.Schalk, et al., Seed Train Optimization in Microcarrier-Based Cell Culture Post In Situ Cell Detachment through Scale-Down Hybrid Modeling. Bioengineering, 2024.
留言框-
